blaOXA-48’in Saptanması İçin İzotermal Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Tekniği ve “Lateral Flow” Saptama Yöntemine Dayalı Hızlı Moleküler Bir Test Formatının Geliştirilmesi


KUŞKUCU M. A. , AYGÜN G. , Karakullukçu A., İmamaova N., KÜÇÜKBASMACI Ö. , MİDİLLİ K.

KLİMİK DERGİSİ, cilt.32, ss.1-18, 2019 (Diğer Kurumların Hakemli Dergileri)

  • Cilt numarası: 32
  • Basım Tarihi: 2019
  • Dergi Adı: KLİMİK DERGİSİ
  • Sayfa Sayıları: ss.1-18

Özet

Amaç: Karbapenem direnci son yıllarda dünya genelinde hastanelerde önemli bir mortalite ve morbidite nedeni olmasıyla ciddi bir tehlike oluşturmaktadır. blaOXA-48 ilk kez 2004 yılında Türkiye’de tanımlandı ve günümüzde karbapenem direncinden sorumlu başlıca mekanizmalardan biri haline gelmiştir. Karbapenemazları kodlayan genlerin saptanmasında moleküler testlerin hızlı, güvenilir ve çeşitli seçeneklerinin bulunmasına karşın; maliyet, iyi eğitimli teknisyen ihtiyacı ve cihaz gereksinimleri bu testlerin yaygın kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sorunları aşabilmek için son yıllarda yeni bazı izotermal amplifikasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Bu tarz yöntemlerden biri olan rekombinaz polimeraz amplifikasyon (RPA) yöntemi hedefin denatürasyonunu gerektirmez ve prob tabanlı saptama yöntemleriyle RPA ürünleri özgün bir cihaz olmadan bile saptanabilmektedir. Bu çalışmada RPA tabanlı 3 izotermal amplifikasyon yöntemiyle “lateral flow” sistemi birleştirilerek blaOXA-48’i saptayacak hızlı ve sahada kolay uygulanabilir bir test formatının geliştirilmesi amaçlandı. Yöntemler: Bu çalışmada hastanemiz hastane infeksiyon kontrol komitesine ait karbapeneme dirençli ve duyarlı koleksiyon kökenleri (24 blaOXA-48-pozitif köken, birer adet blaVIM-, blaIMP-, blaNDM-, blaKPC-pozitif köken ve 10 adet karbapeneme duyarlı blaOXA-48-negatif köken) çalışmaya dahil edildi. Kökenlerin Müller-Hinton agarda 24 saatlik kültürleri hazırlandıktan sonra 1xPCR tamponunda yoğunlukları 0.5 McFarland olacak şekilde süspansiyonları hazırlandı. Testin performansının ve alt saptama sınırının belirlenmesi için blaOXA-48-pozitif kökenden de ayrıca dilüsyonlar hazırlandı. Bu örneklerden kaynatma yöntemiyle nükleik asid izolasyonu yapıldı. Örnekler tasarlanan blaOXA-48 RPA primerleri ve nfo probuyla RPA yöntemi kullanılarak üretici talimatları doğrultusunda amplifiye edildi. RPA ürünlerinin saptanması için “lateral flow” yöntemi kullanıldı. Bulgular: blaOXA-48 enzimi kodlayan bütün kökenler yaklaşık 45 dakika gibi kısa bir sürede hiçbir özel cihaza gerek duymadan saptanabildi. Saptama alt limiti 10 bakteri olarak belirlendi. Karbapenem direncine neden olan diğer enzimleri kodlayan kökenlerde ya da blaOXA-48 kodlamayan kökenlerde pozitif sinyal saptanmadı. Sonuçlar: Basit uygulanabilirliği ve taşınabilir olması dolayısıyla geliştirilen test formatı gerek laboratuvar gerek saha uygulamalarında diğer moleküler testler (polimeraz zincir reaksiyonu [PCR], “real-time” PCR gibi) için bir alternatif olabilecektir. 

Objective: Carbapenem resistance is related with significant morbidity and mortality and has become a real threat to hospitals worldwide in recent years. blaOXA-48 was described first in 2004 in Turkey and became one of the most prevalent mechanisms of carbapenem resistance. Molecular tests are rapid, reliable tools for the detection of carbapenem resistance, but their use is limited due to their cost, requirement for well-trained technicians and highly sophisticated instrumentation. The recombinase polymerase amplification (RPA) assay is isothermal amplification method which doesn’t require specific instrumentation. RPA doesn't require denaturation of target, can be performed at low, constant temperatures. In this study, we aimed to develop a rapid molecular test format based on RPA technique with combination of lateral flow test format for detection of blaOXA-48. Methods: Bacterial strains were obtained from the collection of Hospital Infection Committee. Twenty-four blaOXA-48, one from each of blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaKPC encoding strains and 10 carbapenem-susceptible blaOXA-48-negative strains were included. Fresh cultures were suspended in 1xPCR buffer, the turbidity of the suspensions were adjusted to 0.5 McFarland. Serial dilutions of blaOXA-48-positive strain were prepared for evaluation of test performance and detection of lower limit. Nucleic acid isolation was performed by boiling method. blaOXA48-specific RPA primers and nfo probe were designed and used. RPA reactions performed according to the manufacturer’s instructions. Lateral flow method was used for detection of RPA products. Results: blaOXA-48-positive strains were detected within about 45 minutes without any instrument. Lower detection limit of the test was 10 bacteria. Neither cross-reaction nor false positivity was observed with the strains encoding other resistance genes or carbapenemsusceptible strains